Alapvető tippek a sejttenyészetek hidegkonzervációjához

Alapvető tippek a sejttenyészetek hidegkonzervációjához

A sejtek folytatják az anyagcserét a normál növekedési aktivitás során, amely megköveteli a különféle proteázok részvételét. Amikor a hőmérséklet -70 ° C alá esik, a proteázok nem működnek. Ezért egy rendkívül alacsony hőmérsékletű környezetben a sejtek megállíthatják metabolikus aktivitásukat, és olyan alvó állapotba léphetnek, amely lehetővé teszi a hosszú távú tárolást.

1. Kísérleti anyagok

Alapanyag:

Alaptenyésztési közeg

Szérum (hagyományos FBS/NBS)

Ultrapure munkapad

Steril dimetil -szulfoxid (DMSO)

Steril PBS -foszfát -puffer -sóoldat

Pipettászpisztoly

Elektromos pipettegy

A kísérletek elkészítése

a) A fagyasztó megoldás előkészítése:

Általános sejtek: 55% bazális közepes és 40% szarvasmarha -szérum (FBS/NBS) + 5% DMSO

Vital sejtek: 90% szarvasmarha -szérum (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliquot az elkészített krionzervációs oldatot egy 15 ml -es centrifugacsőbe [fészek], és tárolja 4 ° C -on későbbi használatra.

b) A fagyasztandó sejtek előkészítése:

A sejtek fagyasztása előtt válassza ki a jó növekedési státusú sejteket és a logaritmikus növekedési fázisban, és cserélje ki őket friss közeggel 12-24 órával a fagyasztás előtt, hogy megőrizze a sejtek állapotát.

2. Kísérleti eljárás

1. Vegye figyelembe a fagyasztandó sejtek sűrűségét, amely körülbelül 80%~ 90%. Használjon pipettfegyvert a régi táptalajon történő aspirációhoz, adjon hozzá steril PBS-t, hogy a cellákat 1-2-szer mossa, és távolítsa el a fennmaradó közeget a tenyésztési környezetben.

2. Adjon hozzá egy megfelelő mennyiségű tripszint vagy emésztőlevet, hogy a tripszin beléphessen a sejtekbe, és helyezze be az inkubátorba az emésztéshez. Vegye figyelembe a sejtek állapotát a mikroszkóp alatt: a citoplazma visszahúzódik, és a sejtek már nem kapcsolódnak a lapokhoz. Ezen a ponton adja hozzá a stop megoldást az emésztési folyamat leállításához.

3. Finoman buborékolja meg a sejteket egy hegyével, hogy sejtszuszpenziót képezzen, és centrifugálja a sejtszuszpenziót 1000 fordulat / perc sebességgel 3-5 percig.

Dobja el a felülúszót, adjon hozzá megfelelő mennyiségű fagyasztási oldatot és óvatosan pipettát, hogy a sejtek egyenletesen számoljanak. Állítsa be a cella sűrűségét hidegkonzervációs közeggel, hogy a végső sűrűség 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml legyen.

4. Használjon pipettapisztolót a kriogén csövek elválasztásához a várt kapacitás szerint, és használjon automatikus korlátgépet a kupakhoz és a tömítéshez.

5. A standard hidegkonzervációs program -1 ° C --2 ° C/perc hűtési sebessége, és a fagyasztandó sejtek fokozatosan fagyaszthatók a következő lépések szerint: szobahőmérséklet → 4 ° C (20 perc) → - - - - - - - 20 ° C (30 perc) → -80 ° C ° C (egy éjszakán át) → hosszú távú tárolás folyékony nitrogénben.

Közvetlenül egy fagyasztóban is tárolható -80 ° C -on egy éjszakán át, majd a folyékony nitrogénbe továbbítható tárolás céljából.

A Yongyue Medical egy csúcstechnikai vállalkozás, amely a K + F-re, az orvosbiológiai fogyóeszközök gyártására és értékesítésére szakosodott. Pipetta tippek, pipetták, PCR lemez, sejttenyésztő termékek és egyéb biológiai laboratóriumi fogyóeszközök. A Yongyue Medical méltó a bizalmához és a választásához! Üdvözöljük a konzultációban!